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संक्षिप्त वर्णन:

 

2.1. एसडीई की तैयारी

एसडी के प्रकंदों को हनहर्ब कंपनी (गुरी, कोरिया) से सूखी जड़ी-बूटी के रूप में खरीदा गया था। कोरिया इंस्टीट्यूट ऑफ ओरिएंटल मेडिसिन (केआईओएम) के डॉ. गो-या चोई द्वारा पौधों की सामग्री की वर्गीकरणात्मक पुष्टि की गई। एक वाउचर नमूना (संख्या 2014 एसडीई-6) मानक हर्बल संसाधनों के कोरियाई हर्बेरियम में जमा किया गया था। एसडी (320 ग्राम) के सूखे प्रकंदों को 70% इथेनॉल (2 एच रिफ्लक्स के साथ) के साथ दो बार निकाला गया और फिर अर्क को कम दबाव में केंद्रित किया गया। काढ़े को फ़िल्टर किया गया, लियोफ़िलाइज़ किया गया और 4°C पर संग्रहीत किया गया। कच्चे शुरुआती सामग्रियों से सूखे अर्क की उपज 48.13% (w/w) थी।

 

2.2. मात्रात्मक उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) विश्लेषण

क्रोमैटोग्राफ़िक विश्लेषण एचपीएलसी प्रणाली (वाटर्स कंपनी, मिलफोर्ड, एमए, यूएसए) और एक फोटोडायोड सरणी डिटेक्टर के साथ किया गया था। एसडीई के एचपीएलसी विश्लेषण के लिए, प्राइम-O-ग्लूकोसाइलसीमीफुगिन मानक कोरिया प्रमोशन इंस्टीट्यूट फॉर ट्रेडिशनल मेडिसिन इंडस्ट्री (ग्योंगसन, कोरिया) से खरीदा गया था, औरसेकंड-ओ-ग्लूकोसिलहमौडोल और 4′-O-β-डी-ग्लूकोसिल-5-O-मिथाइलविसामिनोल को हमारी प्रयोगशाला में अलग किया गया और वर्णक्रमीय विश्लेषण, मुख्य रूप से एनएमआर और एमएस द्वारा पहचाना गया।

एसडीई नमूने (0.1 मिलीग्राम) 70% इथेनॉल (10 एमएल) में भंग कर दिए गए थे। क्रोमैटोग्राफ़िक पृथक्करण XSelect HSS T3 C18 कॉलम (4.6 × 250 मिमी, 5) के साथ किया गया थाμएम, वाटर्स कंपनी, मिलफोर्ड, एमए, यूएसए)। मोबाइल चरण में 1.0 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर पानी (बी) में एसीटोनिट्राइल (ए) और 0.1% एसिटिक एसिड शामिल था। मल्टीस्टेप ग्रेडिएंट प्रोग्राम का उपयोग इस प्रकार किया गया: 5% ए (0 मिनट), 5-20% ए (0-10 मिनट), 20% ए (10-23 मिनट), और 20-65% ए (23-40 मिनट) ). डिटेक्शन वेवलेंथ को 210-400 एनएम पर स्कैन किया गया और 254 एनएम पर रिकॉर्ड किया गया। इंजेक्शन की मात्रा 10.0 थीμएल. तीन क्रोमोनों के निर्धारण के लिए मानक समाधान 7.781 मिलीग्राम/एमएल (प्राइम-) की अंतिम सांद्रता पर तैयार किए गए थे।O-ग्लूकोसिलसीमीफुगिन), 31.125 मिलीग्राम/एमएल (4′-O-β-डी-ग्लूकोसिल-5-O-मिथाइलविसामिनोल), और 31.125 मिलीग्राम/एमएल (सेकंड-ओ-ग्लुकोसिलहमौडोल) मेथनॉल में और 4°C पर रखा जाता है।

2.3. सूजनरोधी गतिविधि का मूल्यांकनकृत्रिम परिवेशीय

2.3.1. सेल कल्चर और नमूना उपचार

रॉ 264.7 कोशिकाएं अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन (एटीसीसी, मानसास, वीए, यूएसए) से प्राप्त की गईं और 1% एंटीबायोटिक्स और 5.5% एफबीएस युक्त डीएमईएम माध्यम में विकसित की गईं। कोशिकाओं को 37°C पर 5% CO2 के आर्द्र वातावरण में ऊष्मायन किया गया। कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए, माध्यम को ताजा डीएमईएम माध्यम और 1 पर लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस, सिग्मा-एल्ड्रिच केमिकल कंपनी, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) से बदल दिया गया।μएसडीई (200 या 400) की उपस्थिति या अनुपस्थिति में जी/एमएल जोड़ा गया थाμg/mL) अतिरिक्त 24 घंटों के लिए।

2.3.2. नाइट्रिक ऑक्साइड (NO), प्रोस्टाग्लैंडीन E2 (PGE2), ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर का निर्धारण-α(टीएनएफ-α), और इंटरल्यूकिन-6 (आईएल-6) उत्पादन

कोशिकाओं को एसडीई से उपचारित किया गया और 24 घंटे के लिए एलपीएस से उत्तेजित किया गया। पिछले अध्ययन के अनुसार ग्रिज़ अभिकर्मक का उपयोग करके नाइट्राइट को मापकर NO उत्पादन का विश्लेषण किया गया था [12]. सूजन संबंधी साइटोकिन्स PGE2, TNF- का स्रावα, और IL-6 का निर्धारण निर्माता के निर्देशों के अनुसार एलिसा किट (R&D सिस्टम) का उपयोग करके किया गया था। NO और साइटोकिन उत्पादन पर SDE के प्रभाव को वॉलैक एनविज़न का उपयोग करके 540 एनएम या 450 एनएम पर निर्धारित किया गया था™माइक्रोप्लेट रीडर (पर्किनएल्मर)।

2.4. एंटीऑस्टियोआर्थराइटिस गतिविधि का मूल्यांकनविवो में

2.4.1. पशु

नर स्प्रैग-डावले चूहों (7 सप्ताह पुराने) को समताको इंक. (ओसान, कोरिया) से खरीदा गया था और 12 घंटे के प्रकाश/अंधेरे चक्र के साथ नियंत्रित परिस्थितियों में रखा गया था।डिग्री सेल्सियस और% नमी। चूहों को प्रयोगशाला आहार और पानी उपलब्ध कराया गयायथेच्छ. सभी प्रायोगिक प्रक्रियाएं राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) दिशानिर्देशों के अनुपालन में की गईं और डेजॉन विश्वविद्यालय (डेजॉन, कोरिया गणराज्य) की पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित की गईं।

2.4.2. चूहों में एमआईए के साथ ओए का प्रेरण

अध्ययन शुरू होने से पहले जानवरों को यादृच्छिक बनाया गया और उपचार समूहों को सौंपा गया (प्रति समूह)। एमआईए समाधान (3 मिलीग्राम/50μएल (0.9% सेलाइन) को केटामाइन और ज़ाइलाज़ीन के मिश्रण से प्रेरित एनेस्थीसिया के तहत सीधे दाहिने घुटने के इंट्रा-आर्टिकुलर स्पेस में इंजेक्ट किया गया था। चूहों को बेतरतीब ढंग से चार समूहों में विभाजित किया गया था: (1) बिना एमआईए इंजेक्शन वाला खारा समूह, (2) एमआईए इंजेक्शन वाला एमआईए समूह, (3) एमआईए इंजेक्शन वाला एसडीई-उपचारित समूह (200 मिलीग्राम/किग्रा), और (4) ) एमआईए इंजेक्शन के साथ इंडोमिथैसिन- (आईएम-) उपचारित समूह (2 मिलीग्राम/किग्रा)। चूहों को 4 सप्ताह के लिए एमआईए इंजेक्शन से 1 सप्ताह पहले एसडीई और आईएम के साथ मौखिक रूप से प्रशासित किया गया था। इस अध्ययन में प्रयुक्त एसडीई और आईएम की खुराक पिछले अध्ययनों में नियोजित लोगों पर आधारित थी [10,13,14].

2.4.3. हिंदपाव भार-वहन वितरण का माप

OA प्रेरण के बाद, हिंद पंजों की वजन वहन करने की क्षमता में मूल संतुलन बाधित हो गया। भार वहन सहनशीलता में परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए एक अक्षमता परीक्षक (लिंटन इंस्ट्रूमेंटेशन, नॉरफ़ॉक, यूके) का उपयोग किया गया था। चूहों को सावधानीपूर्वक मापने वाले कक्ष में रखा गया। पिछले अंग द्वारा लगाया गया भार वहन करने वाला बल 3 एस की अवधि में औसत था। वजन वितरण अनुपात की गणना निम्नलिखित समीकरण द्वारा की गई थी: [दाएं हिंद अंग पर वजन/(दाएं हिंद अंग पर वजन + बाएं हिंद अंग पर वजन)] × 100 [15].

2.4.4. सीरम साइटोकिन स्तर का मापन

रक्त के नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1,500 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया; फिर सीरम को एकत्र किया गया और उपयोग होने तक -70°C पर संग्रहीत किया गया। IL-1 का स्तरβ, आईएल-6, टीएनएफ-α, और सीरम में PGE2 को निर्माता के निर्देशों के अनुसार R&D सिस्टम्स (मिनियापोलिस, एमएन, यूएसए) से एलिसा किट का उपयोग करके मापा गया था।

2.4.5. वास्तविक समय मात्रात्मक आरटी-पीसीआर विश्लेषण

टीआरआई अभिकर्मक® (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) का उपयोग करके घुटने के जोड़ के ऊतकों से कुल आरएनए निकाला गया, इसे सीडीएनए में रिवर्स-ट्रांसक्राइब किया गया और एसवाईबीआर ग्रीन (एप्लाइड बायोसिस्टम्स) के साथ टीएम वन स्टेप आरटी पीसीआर किट का उपयोग करके पीसीआर-प्रवर्धित किया गया। , ग्रैंड आइलैंड, एनवाई, यूएसए)। एप्लाइड बायोसिस्टम्स 7500 रियल-टाइम पीसीआर सिस्टम (एप्लाइड बायोसिस्टम्स, ग्रैंड आइलैंड, एनवाई, यूएसए) का उपयोग करके वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर का प्रदर्शन किया गया था। प्राइमर अनुक्रम और जांच-अनुक्रम तालिका में दिखाए गए हैं1. निर्माता के निर्देशों (एप्लाइड बायोसिस्टम्स, फोस्टर, सीए, यूएसए) के अनुसार डीएनए पोलीमरेज़ युक्त टैकमैन® यूनिवर्सल पीसीआर मास्टर मिश्रण के साथ नमूना सीडीएनए के विभाजन और जीएपीडीएच सीडीएनए की समान मात्रा को बढ़ाया गया था। पीसीआर स्थितियां 50 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट, 94 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट, 95 डिग्री सेल्सियस पर 15 सेकंड और 40 चक्रों के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट थीं। निर्माता के निर्देशों के अनुसार, लक्ष्य जीन की सांद्रता तुलनात्मक सीटी (प्रवर्धन प्लॉट और थ्रेशोल्ड के बीच क्रॉस-पॉइंट पर थ्रेसहोल्ड चक्र संख्या) विधि का उपयोग करके निर्धारित की गई थी।

एफओबी मूल्य:यूएस $0.5 - 9,999/टुकड़ा

न्यूनतम आर्डर राशि:100 टुकड़ा/टुकड़े

आपूर्ति की योग्यता:प्रति माह 10000 पीस/टुकड़े