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संक्षिप्त वर्णन:

 

2.1. एसडीई की तैयारी

एसडी के प्रकंदों को हनहर्ब कंपनी (गुरी, कोरिया) से सूखी जड़ी-बूटी के रूप में खरीदा गया था। कोरिया इंस्टीट्यूट ऑफ ओरिएंटल मेडिसिन (केआईओएम) के डॉ. गो-या चोई द्वारा पादप सामग्री की वर्गीकरणीय पुष्टि की गई थी। एक वाउचर नमूना (संख्या 2014 एसडीई-6) को स्टैंडर्ड हर्बल रिसोर्सेज के कोरियाई हर्बेरियम में जमा किया गया था। एसडी के सूखे प्रकंदों (320 ग्राम) को 70% इथेनॉल (2 घंटे के रिफ्लक्स के साथ) के साथ दो बार निकाला गया और फिर अर्क को कम दबाव में सांद्रित किया गया। काढ़े को छानकर, द्रव-रासायनिक किया गया और 4°C पर संग्रहित किया गया। अपरिष्कृत प्रारंभिक सामग्रियों से सूखे अर्क की उपज 48.13% (w/w) थी।

 

2.2. मात्रात्मक उच्च-प्रदर्शन द्रव क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) विश्लेषण

क्रोमैटोग्राफिक विश्लेषण एक HPLC प्रणाली (वाटर्स कंपनी, मिलफोर्ड, मैसाचुसेट्स, यूएसए) और एक फोटोडायोड ऐरे डिटेक्टर के साथ किया गया। SDE के HPLC विश्लेषण के लिए, प्राथमिक-O-ग्लूकोसिलसिमिफुगिन मानक कोरिया प्रमोशन इंस्टीट्यूट फॉर ट्रेडिशनल मेडिसिन इंडस्ट्री (ग्योंगसन, कोरिया) से खरीदा गया था, औरसेकंड-O-ग्लूकोसिलहामॉडोल और 4′-O-β-डी-ग्लूकोसिल-5-O-मेथिलविसामिनोलोल को हमारी प्रयोगशाला में पृथक किया गया और वर्णक्रमीय विश्लेषण, मुख्यतः एनएमआर और एमएस द्वारा पहचाना गया।

एसडीई नमूने (0.1 मिलीग्राम) 70% इथेनॉल (10 मिलीलीटर) में घोले गए। क्रोमैटोग्राफिक पृथक्करण एक एक्ससिलेक्ट एचएसएस टी3 सी18 कॉलम (4.6 × 250 मिमी, 5) के साथ किया गया।μमीटर, वाटर्स कंपनी, मिलफोर्ड, एमए, यूएसए)। मोबाइल चरण में 1.0 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर एसीटोनिट्राइल (ए) और पानी (बी) में 0.1% एसिटिक एसिड शामिल था। एक मल्टीस्टेप ग्रेडिएंट प्रोग्राम का उपयोग इस प्रकार किया गया था: 5% ए (0 मिनट), 5-20% ए (0-10 मिनट), 20% ए (10-23 मिनट), और 20-65% ए (23-40 मिनट)। पता लगाने की तरंग दैर्ध्य को 210-400 एनएम पर स्कैन किया गया और 254 एनएम पर दर्ज किया गया। इंजेक्शन की मात्रा 10.0 थीμएल. तीन क्रोमोनों के निर्धारण के लिए मानक समाधान 7.781 मिलीग्राम/एमएल (प्राइम-) की अंतिम सांद्रता पर तैयार किए गए थे।O-ग्लूकोसिलसिमिफुगिन), 31.125 मिलीग्राम/एमएल (4′-O-β-डी-ग्लूकोसिल-5-O-मेथिलविसामिनोल), और 31.125 मिलीग्राम/एमएल (सेकंड-O-ग्लूकोसिलहामाडोल) को मेथनॉल में मिलाया गया और 4°C पर रखा गया।

2.3. सूजन-रोधी गतिविधि का मूल्यांकनकृत्रिम परिवेशीय

2.3.1. कोशिका संवर्धन और नमूना उपचार

अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन (ATCC, मानसास, वर्जीनिया, अमेरिका) से RAW 264.7 कोशिकाएँ प्राप्त की गईं और उन्हें 1% एंटीबायोटिक्स और 5.5% FBS युक्त DMEM माध्यम में उगाया गया। कोशिकाओं को 37°C पर 5% CO2 के आर्द्र वातावरण में इनक्यूबेट किया गया। कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए, माध्यम को ताज़ा DMEM माध्यम और लिपोपॉलीसेकेराइड (LPS, सिग्मा-एल्ड्रिच केमिकल कंपनी, सेंट लुइस, मिसौरी, अमेरिका) से 1% पर प्रतिस्थापित किया गया।μएसडीई (200 या 400) की उपस्थिति या अनुपस्थिति में ग्राम/एमएल मिलाया गयाμग्राम/एमएल) को अतिरिक्त 24 घंटे के लिए रखा जाना चाहिए।

2.3.2. नाइट्रिक ऑक्साइड (NO), प्रोस्टाग्लैंडीन E2 (PGE2), ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर का निर्धारण-α(टीएनएफ-α), और इंटरल्यूकिन-6 (IL-6) उत्पादन

कोशिकाओं को एसडीई से उपचारित किया गया और 24 घंटे के लिए एलपीएस से उत्तेजित किया गया। पिछले अध्ययन के अनुसार, ग्रीस अभिकर्मक का उपयोग करके नाइट्राइट को मापकर नाइट्रोजन ऑक्साइड (NO) उत्पादन का विश्लेषण किया गया [12] सूजन पैदा करने वाले साइटोकिन्स PGE2, TNF- का स्रावα, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार IL-6 का निर्धारण ELISA किट (R&D सिस्टम) का उपयोग करके किया गया। NO और साइटोकाइन उत्पादन पर SDE के प्रभावों को Wallac EnVision का उपयोग करके 540 nm या 450 nm पर निर्धारित किया गया।™माइक्रोप्लेट रीडर (पर्किनएल्मर)।

2.4. एंटीऑस्टियोआर्थराइटिस गतिविधि का मूल्यांकनइन विवो

2.4.1. पशु

नर स्प्रैग-डॉली चूहों (7 सप्ताह के) को समताको इंक. (ओसान, कोरिया) से खरीदा गया और 12 घंटे के प्रकाश/अंधेरे चक्र के साथ नियंत्रित परिस्थितियों में रखा गया।डिग्री सेल्सियस और% आर्द्रता। चूहों को प्रयोगशाला आहार और पानी दिया गयायथेच्छसभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाएं राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) के दिशानिर्देशों के अनुपालन में की गईं और डेजॉन विश्वविद्यालय (डेजॉन, कोरिया गणराज्य) की पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित की गईं।

2.4.2. चूहों में एमआईए के साथ ओए का प्रेरण

अध्ययन शुरू होने से पहले जानवरों को यादृच्छिक रूप से वर्गीकृत किया गया और उपचार समूहों में रखा गया (प्रति समूह)। एमआईए घोल (3 मिलीग्राम/50μ0.9% सलाइन का एल) को केटामाइन और ज़ाइलाज़िन के मिश्रण से प्रेरित एनेस्थीसिया के तहत सीधे दाहिने घुटने के इंट्रा-आर्टिकुलर स्पेस में इंजेक्ट किया गया। चूहों को यादृच्छिक रूप से चार समूहों में विभाजित किया गया: (1) बिना एमआईए इंजेक्शन वाला सलाइन समूह, (2) एमआईए इंजेक्शन वाला एमआईए समूह, (3) एमआईए इंजेक्शन के साथ एसडीई-उपचारित समूह (200 मिलीग्राम/किग्रा), और (4) एमआईए इंजेक्शन के साथ इंडोमेथेसिन- (आईएम-) उपचारित समूह (2 मिलीग्राम/किग्रा)। चूहों को एमआईए इंजेक्शन से 1 सप्ताह पहले 4 सप्ताह तक एसडीई और आईएम के साथ मौखिक रूप से प्रशासित किया गया था। इस अध्ययन में उपयोग की गई एसडीई और आईएम की खुराक पिछले अध्ययनों में प्रयुक्त खुराक पर आधारित थी।10,13,14].

2.4.3. पिछले पंजे के भार-असर वितरण का मापन

ओए प्रेरण के बाद, पिछले पंजों की भार वहन क्षमता का मूल संतुलन बिगड़ गया। भार वहन सहनशीलता में परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए एक अशक्तता परीक्षक (लिंटन उपकरण, नॉरफ़ॉक, यूके) का उपयोग किया गया। चूहों को सावधानीपूर्वक मापक कक्ष में रखा गया। पिछले अंग द्वारा लगाए गए भार वहन बल का 3 सेकंड की अवधि में औसत निकाला गया। भार वितरण अनुपात की गणना निम्नलिखित समीकरण द्वारा की गई: [दाएँ पिछले अंग पर भार/(दाएँ पिछले अंग पर भार + बाएँ पिछले अंग पर भार)] × 100 [15].

2.4.4. सीरम साइटोकाइन स्तरों का मापन

रक्त के नमूनों को 1,500 ग्राम पर 4°C पर 10 मिनट तक सेंट्रीफ्यूज किया गया; फिर सीरम एकत्र किया गया और उपयोग होने तक -70°C पर संग्रहीत किया गया। IL-1 का स्तरβ, आईएल-6, टीएनएफ-α, और सीरम में PGE2 को निर्माता के निर्देशों के अनुसार R&D सिस्टम (मिनियापोलिस, एमएन, यूएसए) से एलिसा किट का उपयोग करके मापा गया।

2.4.5. वास्तविक समय मात्रात्मक आरटी-पीसीआर विश्लेषण

घुटने के जोड़ के ऊतक से TRI अभिकर्मक® (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, मिसौरी, यूएसए) का उपयोग करके कुल RNA निकाला गया, cDNA में रिवर्स-ट्रांसक्राइब किया गया और SYBR ग्रीन (एप्लाइड बायोसिस्टम्स, ग्रैंड आइलैंड, न्यूयॉर्क, यूएसए) के साथ TM वन स्टेप RT PCR किट का उपयोग करके PCR-प्रवर्धित किया गया। एप्लाइड बायोसिस्टम्स 7500 रियल-टाइम PCR सिस्टम (एप्लाइड बायोसिस्टम्स, ग्रैंड आइलैंड, न्यूयॉर्क, यूएसए) का उपयोग करके रियल-टाइम क्वांटिटेटिव PCR किया गया। प्राइमर अनुक्रम और प्रोब-अनुक्रम तालिका में दिखाए गए हैं।1नमूना सीडीएनए के अंशों और GAPDH सीडीएनए की समान मात्रा को निर्माता के निर्देशों (एप्लाइड बायोसिस्टम्स, फोस्टर, कैलिफ़ोर्निया, यूएसए) के अनुसार डीएनए पॉलीमरेज़ युक्त TaqMan® यूनिवर्सल पीसीआर मास्टर मिश्रण से प्रवर्धित किया गया। पीसीआर की स्थितियाँ 50°C पर 2 मिनट, 94°C पर 10 मिनट, 95°C पर 15 सेकंड और 60°C पर 40 चक्रों के लिए 1 मिनट थीं। निर्माता के निर्देशों के अनुसार, लक्ष्य जीन की सांद्रता तुलनात्मक Ct (प्रवर्धन आलेख और सीमा के बीच क्रॉस-पॉइंट पर सीमा चक्र संख्या) विधि का उपयोग करके निर्धारित की गई थी।

एफओबी मूल्य:यूएस $0.5 - 9,999 / पीस

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